Investigation of species-specific allosteric binding sites in glycolytic enzymes via AlloSigMA and molecular dynamics simulations

Abstract

In previous studies of our research group, allosteric sites have been proposed to be used as drug targets in species-specific drug design studies for phosphofructokinase (PFK), glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase (GADPH) and pyruvate kinase (PK) that belong to three species bacteria, parasite, and human and are essential enzymes in the glycolytic pathway. In this thesis, they were further investigated by various tools such as AlloSigMA and MD simulations. In addition to proposed allosteric sites, known allosteric sites reported by experimental studies for S. aureus PFK and PK enzymes were also investigated. In the first part, AlloSigMA was used to perturb the residues at the proposed and/or known allosteric sites in order to evaluate their allosteric capacities and their effects on protein dynamics. Accordingly, a reduced dynamics in the catalytic sites indicating allosteric inhibition was observed for most of the proposed allosteric sites whereas either an opposite or no effect was observed for known allosteric sites. In addition, partial allosteric inhibition was observed for some of the proposed allosteric sites in human species. In the second part of this thesis, Molecular Dynamics simulations of a total of nine runs, each 100 ns long, were performed for S. aureus phosphofructokinase enzyme in apo and constrained states which incorporated bond restraints at the proposed and known allosteric sites. Here, the goal was to investigate the effect of restraints on the protein's global dynamics. RMSD/RMSF, principal component analysis, the change in orthogonal principal axes, and the mean square distance fluctuation between each pair of residues were determined. According to PCA analysis, increase in the correlation of positional fluctuations between each pair of residues in the chains and domains were observed. Based on the mean square distance fluctuation between residue pairs, each dimer started to communicate more within itself when switched to constrained state.

Araştırma grubumuzun önceki çalışmalarında, türe özgü ilaç tasarım çalışmalarında hedef ilaç bölgesi olarak kullanılması amacıyla bakteri, parazit ve insan türlerine ait glikolitik yolaktaki temel enzimler olan fosfofruktokinaz (PFK), gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GADPH) ve pürivat kinaz (PK) enzimleri için allosterik bölgeler önerilmiştir. Bu tezde, AlloSigMA aracı ve MD simülasyonları gibi çeşitli araçlarla daha detaylı araştırıldılar. Önerilen allosterik bölgelere ek olarak, S. aureus PFK ve PK enzimleri için deneysel çalışmalarla bildirilen bilinen allosterik bölgeler de araştırıldı. İlk bölümde, allosterik kapasitelerini ve protein dinamiği üzerindeki etkilerini değerlendirmek için önerilen ve/veya bilinen allosterik bölgelerdeki rezidülerin dinamiğini bozmak için AlloSigMA aracı kullanıldı. Buna göre, önerilen allosterik bölgelerin çoğu için katalitik bölgelerde allosterik inhibisyonu gösteren dinamikte bir azalma gözlemlenirken, bilinen allosterik bölgeler için bir ters etki veya hiç etki gözlenmedi. Ek olarak, insan türlerinde önerilen allosterik bölgelerin bazıları için kısmi allosterik inhibisyon gözlemlendi. Bu tezin ikinci bölümünde, S. aureus fosfofruktokinaz enzimi için önerilen ve bilinen allosterik bölgelerde bağ kısıtlamalarını içeren apo ve kısıtlı durumlarda her biri 100 ns uzunluğunda toplam dokuz koşu Moleküler Dinamik simülasyonları gerçekleştirilmiştir. Burada amaç, kısıtlamaların proteinin global dinamikleri üzerindeki etkisini araştırmaktı. RMSD/RMSF, temel bileşen analizi, ortogonal ana eksenlerdeki değişiklik ve her bir rezidü çifti arasındaki ortalama mesafe dalgalanması belirlendi. PCA analizine göre, zincirlerdeki ve domainlerdeki her bir rezidü çifti arasındaki konumsal dalgalanmaların korelasyonunda artış gözlemlendi. Rezidü çiftleri arasındaki ortalama kare mesafe dalgalanmasına bağlı olarak, her dimer kısıtlı duruma geçtiğinde kendi içinde daha fazla iletişim kurmaya başladı.