Reaktif oksijen türevlerinin etkilediği hücre içi sinyal ileti proteinlerinin western blot yöntimi ile saptanması

Abstract

1. ÖZET Hücre büyümesinin durması, çevresel stress faktörlerine karşı hücrenin genomik stabilite ve bütünlüğünü sağlamak açısından çok önemlidir. Astrositik özellikteki transforme bir hücre soyu olan C6 glioma hücrelerini kullanarak bir reaktif oksijen türevi olan hidrojen peroksit (H202)'in hücre içi sinyal ileti proteinleri olan MAPK'lara olan etkilerini araştırdık. H202, birer MAPK olan ERK1/ERK2 ve JNK1/JNK2 proteinlerini farklı şekilde etkiledi. Hücrelere H202 uygulaması sonucu ERK1/ERK2 serin/treonin uçlarmdan fosforile olarak aktive olurken, JNK1/JNK2 'nin fosforilasyonunda bir değişiklik olmadı. Diğer yandan, bir protein tirozin fosfataz inhibitörü olan vanadat'm H202'in ERK1/ERK2 ve JNK1/JNK2 üzerine olan etkisini değiştirip değiştirmediğini araştırdık. Vanadat, fosforile olmuş proteinlerin fosfatazlar tarafindan defosforile olmasım engelleyerek etkilerini arttırır. Hücrelere vanadat uygulaması, ERK1/ERK2 ve JNK1/JNK2 proteMerinin H202 tarafindan fosforilasyonunu potansiyalize etti. Vanadat'm ERK1/ERK2 üzerine olan güçlendirici etkisi daha belirgin ve spesifik iken, vanadat, JNK1/JNK2 ve ilgili diğer proteinlerin de fosforilasyonunu arttırdı. Sonuç olarak, bu bulgular, H202 ile yaratılan hücre içi oksidatif stresin C6 glioma hücrelerinde MAPK'lan farklı şekilde regüle ettiğini göstermiştir. ERKİ /ERK2 'nin H202 tarafindan ve JNK1/JNK2 'in vanadat tarafindan aktive olması, hipoksinin, tumor anjiogenezi, maügn prognoz ve uzak metastaz ile sonuçlanan olayları başlatabilen pek çok gen ekspresyonuna yol açabileceğinin kamtlarmdan birisidir.2. SUMMARY Cell growth arrest is an important mechanism in mamtaining genomic stability and integrity in response to environmental stress. Using the transformed astrocytic cell line C6 glioma cells, we investigated the role of the reactive oxygen species, hydrogen peroxide (H202), in the intracellular signal transduction proteins, MAP kinases. H202, differentially regulated the MAP kinases, ERK1/ERK2 and JNK1/JNK2. Exposure of cells to H202 induced serine/threonine phosphorylation and activation of ERK1/ERK2, whereas there was no change in the phosphorylation status of JNK1/JNK2. Furthermore, we investigated whether the protein tyrosine phosphatase inhibitor, vanadat, alters the effect of H202 on ERK1/ERK2 and JNK1/JNK2. Vanadat potentiates the phosphorylation and activities of proteins via inhibiting their dephosphorylation by phosphatases. In fact, vanadat potentiated the H202-induced phosphorylation of ERK1/ERK2 and JNK1/JNK2. However, while the strengthening effect of vanadat on ERK1/ERK2 was stronger and more specific, vanadat increased the phosphorylation of both JNK1/JNK2 and olher proteins related to JNK1/JNK2. In conclusion, this study demonstrated that the oxidative stress stimulated by H202 differentially regulates the MAP kinases in C6 glioma cells. The activation of ERK1/ERK2 by H202, and JNK1/JNK2 by vanadat, provide support for the capability of hypoxia to trigger various gene expressions leading to events resulting in tumor angiogenesis, malign prognosis and metastases.